Otopsi yapilan insan doku bolumlerinde mikroglia siniflandirmasindaki basari, oncelikle bu amac icin kullanilan antikorlara ve ayni zamanda calisilan beyin dokusunun nasil korunduguna baglidir. Immunohistokimya icin mikroglial belirteclerle ilgili yayinlanmis bircok calisma, genis olcude sabitlenmis doku kesitlerinde guclu immunoreaktivite ureten antikorlarla sinirlandirilmistir. Bu, ozellikle insan mikroglial calismalari icin en yaygin olarak kullanilan HLA-DR icin gecerlidir, cunku mevcut antikorlar cok cesitli korunmus beyin dokusu uzerinde canli sonuclar verebilir.
Calisma referanslarinda HLA-DR icin birincidir ve 30 yillik calismalari kapsayan en son referanslardir AD mikroglia’da HLA-DR’nin islevi hala belirsizdir. Bu protein, islenmis antijenleri AD mikro ortaminda bulunmayan T lenfositlerine sunma islevi gorur. AD mikroglia’da HLA-DR’nin yukari regulasyonuna yol acan sinyallesme tanimlanmamistir. Son yillarda, sitoskeletal reorganizasyon ve hucre hareketliliginde rol oynayan aktin baglayici bir proteini taniyan IBA-1 belirteci de, guclu boyama antikorlarinin mevcudiyeti nedeniyle mikroglia’yi tanimlamak icin yaygin bir sekilde kullanilmistir. IBA-1 antikorlari, aktive mikrogliada sinirli yukari regulasyona sahip tum mikroglialari taniyor gibi gorunmektedir, ancak bu yorum ayni zamanda mikroglial morfoloji ile ilgili gozlemlere de baglidir.


Doku kesitlerinde guclu sonuclar ureten antikorlarin kullanimi, diger bircok antijenik belirtec mevcut oldugu icin, hastaliktaki mikroglial islevi anlamamizi engellemis olabilir, ancak bunlari dokuda ortaya cikarmak icin uygun antikorlar mevcut degildir. Islevin en yararli markorleri, antijenikligi fiksasyon kosullarindan ve ayrica glikosilasyon derecesinden onemli olcude etkilenen hucre yuzeyi glikosile proteinlerdir. Bircok arastirmaci icin en yaygin olarak bulunan dokular, uzun sureler boyunca formalinle sabitlenmis ve ardindan parafine (FFPE) gomulmus doku bloklaridir; bu surec, ksilen ile muameleleri icerir. Bu koruma yontemleri, antikorlarin bircok antijeni, ozellikle de hucre yuzeyi glikoproteinlerini tanima yetenegini guclu bir sekilde etkiler.Insan Beyninde Mikroglial Fenotipleme ile Ilgili Calismalar


FFPE dokusunda antijen tanimada etkili olan antikorlarin sayisi, mevcut antikorlarin kucuk bir yuzdesidir. Ek olarak, FFPE dokusunun kullanimi, cogu antikorun calismasi icin genellikle antijen geri kazanim tekniklerinin uygulanmasini gerektirir; bu yontemlerin bir dizi vardir ancak bunlarin basarili bir sekilde uygulanmasi operator becerisine baglidir ve tekrarlanabilir olmayabilir. Belirtildigi gibi, insan beyni orneklerinde mikrogliayi siniflandirmak icin M1 ve M2 benzeri semalarin uygulanabilirligi elestirilmistir, cunku siniflandirma antijenlerinin cogu doku mikroglialarinda kanitlanmamistir FFPE dokusunda antijen tanimada etkili olan antikorlarin sayisi, mevcut antikorlarin kucuk bir yuzdesidir.


AD’de Mikroglial Fonksiyonel Proteinlerle Ilgili Onceki Calismalar
AD’li beyinlerde mikroglia tarafindan patoloji ile iliskili alanlarda artan HLA-DR ekspresyonunun ilk calismalarindan bu yana AD’li beyne bir dizi makrofaj belirtecinin ekspresyonu uygulanmistir. Dokular. Bunlar arasinda beta II integrinleri (CD11a, b ve c ve CD18 – tamamlayici ve fagositik reseptorler), immunoglobulin Fc reseptorleri (CD16, CD32, CD64), lipopolisakkarit reseptoru CD14, makrofaj koloni uyarici faktor reseptoru-1 (CSF-1R; CD115), tip B copcu reseptoru CD36, ferritin, sinyal duzenleyici protein beta-1 ve progranulin bulunur. CD43 ve TMEM106B belirteclerinin, kontrollere kiyasla AD mikrogliada asagi regule edildigi gosterilmistir. Bu, alan sinirlamalari nedeniyle eksIk bir listeyi temsil eder, ancak bu belirteclerin cogu sitotoksisiteden ziyade fagositik islevle ilgilidir.Insan Beyninde Mikroglial Fenotipleme ile Ilgili Calismalar


Ferritin, her yerde bulunan bir demir tasima proteini oldugu icin mikroglial aktivasyonla iliskili benzersiz ozelliklere sahiptir, ancak dokuda secici olarak aktif mikroglia populasyonunu belirledigi gorulmektedir. Potansiyel sitotoksisiteyi dogrudan gostermek icin, mikrogliada artmis sitokin seviyelerinin gosterilmesi gereklidir. Son 30 yilda, doku kesitlerinde sitokinlerin profilini cikarmak icin immunohistokimyayi kullanan cok az calisma yapilmistir. Griffin ve meslektaslari tarafindan yapilan bir dizi calisma, IL-1; ifade eden mikroglia’nin farkli tipte plak ve dugumlerle iliskili oldugunu gosterdi.


Yaygin noritik ve noritik olmayan plaklar en fazla IL-1 a pozitif mikrogliaya sahipken, yogun cekirdek noritik ve noritik olmayan plaklar onemli olcude az sayida IL-1 a pozitif mikrogliaya sahipti. Bu sonuclar, bu mikroglia populasyonunun plak olusumunun erken asamalarinda yer aldigini gostermektedir. Bu markorun kullanilmasi, IL-1pozitif mikroglianin parahipokampal girusta norofibriler yumak olusumunda rol oynadigini gostermistir. Baska bir calismada, IL-1 ve TNF’nin insan AD dokusunda mikrogliada lokalize olabilecegi gosterilmistir. Sinirli sayida calisma, sitokinler gibi salgilanan proteinleri tespit etmenin teknik zorluklarini vurgulamaktadir.
Griffin ve meslektaslari, immunohistokimya icin FFPE dokusunu kullandi. Sitokinleri dokuya yerlestirmek icin kisa sabitlenmis mikrotom kesim bolumlerini kullanarak birkac kez denedik ve hicbir zaman basarili olamadik. Bu molekuller, membran lokalizasyonu yerine salgilandigindan, FFPE’de yer alan sert fiksasyonun onlari tutturmak icin ve ardindan antikor erisimine izin vermek icin antijen geri kazanimina ihtiyac duyulmasi mumkundur. Kisa sabitlenmis beyin dokusu materyalleri ile, bu cozunur proteinler, lokalizasyon icin yerinde yeterince sabitlenmeyebilir.


Mikroglial Fenotipleme Icin Antikor Secimi
Ilgili proteinlerin yerini ortaya cikarmak icin gereken uygun antikorlarin secimi soz konusu oldugunda, insan beyni immunohistokimyasinin tum alani birkac sinirlamaya sahiptir. Ilk olarak, genellikle fare veya tavsan kokenli bir monoklonal antikor olan ve dolayisiyla hedef proteinin kucuk bir bolumunu temsil eden bir epitopa ozgu olan antikor, ozgunluk gosterebilmelidir, yani, hedef proteini yerinde tanimaktadir.Ve diger proteinlerle capraz reaksiyona girmez. Ikinci olarak, antikor, dokudaki hedef proteini tanimasi dogrulanabilirse, ozgullugu ve hassasiyeti fiksasyon kosullarindan etkilenebilir.
Deneyimlere gore, daha genis bir antikor yelpazesine sahip mikroglial antijenlerin incelenmesi, paraformaldehit (formalin degil) icinde kisa bir sure (48 saat) sabitlenmis beyin dokusu kullanilarak daha az sorunlu olmustur ve ardindan dondurucu bir mikrotom kullanilarak kriyoproteksiyona tabi tutulmus ve kesilmistir. Bu islem, dokunun parafine gomulmesiyle ilgili sert islemlerden kacinir. Yillar icinde, mikroglial proteinler CD87, RAGE, CD33, TREM-2, TLR-2, -3, -4 ile birlikte HLA-DR, IBA-1, CD68’i basariyla tanimlanmistir. (AD dokulari)


Bu dokulari kullanirken antikorlarla ilgili deneyimimiz, basarili immunolokalizasyon sansini artirmaya yardimci olan bazi ozellikleri belirlenmistir. Bir sirket – Ar-Ge Sistemleri – Biotechne, Minneapolis, MN – endustri icin nispeten benzersiz bir strateji kullanarak antikorlarinin cogunu uretti. Antikorlarinin cogu, okaryotik hucrelerde ifade edilen ilgi konusu proteinlerden hazirlanmistir. Bu proteinler, insan dokularinda beklenene benzer sekilde glikosile edilecektir. Ek olarak, immunize edici proteinler genellikle dogal proteinin cogunu kaplar ve boylece birden fazla antijenik epitop icermenin yani sira antijenligi etkileyen ikincil protein yapisinin bir kismini korur. Bu proteinler, immunojen olarak 10-20 amino asitlik kisa sentetik peptit sekanslarini kullanan ve daha sonra hayvan immunizasyonundan once bir tasiyiciya konjuge olan bircok sirketin stratejisinden daha ustun immunojeniklige sahip antikorlar uretir.
Ar-Ge Sistemleri afinite saflastirilmis poliklonal antikorlarla ilgili deneyimimiz genellikle hafif sabitlenmis dokularda kullanim icin elverisli olmustur. Bu antikorlar, fiksasyondan ciddi sekilde etkilenmeyen proteinler uzerindeki epitoplari tanimlama olasiligini artirabilen bir dizi epitop icerecektir. Poliklonal hazirlamak icin buyuk protein antijenlerinin kullanilmasi, diger ilgili proteinlerle capraz reaktivite potansiyeli oldugundan bazi dezavantajlara sahiptir. Kalite kontrol, doku reaktivitesinin giderildigini gostermek icin antikorun protein absorpsiyonunu gerceklestirebilmesine baglidir,


AD beyinlerinde mikrogliayi tanimlamak icin Toll benzeri reseptore (TLR) -3 (AF1487) yonelik bir Ar-Ge Sistemleri antikoru ve CD206’ya yonelik bir Ar-Ge Sistemleri poliklonal antikoru (AF2535) kullanarak deneyimimizi gostermektedir. ), Mikroglia’yi tanimlayamayan (D ve E panelleri). TLR-3 poliklonal antikoru, insan beyni mikrogliasindaki yapilari tanimlayabilir. Bir yorum, bati lekeleri beyin materyali gibi karmasIk materyal kullanilarak gerceklestiriliyorsa, tam uzunluktaki proteinin yani sira diger protein bantlarinin da varligi beklenmelidir.
Islevsel proteinlerin cogu ya normal islevleri sirasinda bolunur, ornegin lider sekanslarin kaybi, salgilanan formlar uretmek icin bolunur veya hucresel metabolizmanin bir parcasi olarak parcalanir. Ilginc bir sekilde, ayni immunize edici protein ile uretilen TLR-3’e yonelik bir monoklonal antikor, dokuda mikroglia boyayamamistir, ancak bu antikor, immunize edici proteinde bulunan yalnizca tek bir epitop icin spesifik olacaktir. CD206’ya karsi bir Ar-Ge sistemleri antikoru ile benzer deneyimler olmustur. Okaryotik bir hucre eksprese edilmis proteine karsi uretilen. Bu protein, ekspresyonu IL-4 varliginda induklendiginden, M2a alternatif aktivasyonu icin prototip bir markor olarak tanimlanmistir.


Bu antikoru, insan beyninde alternatif aktivasyon mikroglialarina dair kanit olup olmadigini belirlemek icin kullanilmistir Western blotlarda beyin numunelerindeki spesifik bantlari tespit edebilen bu antikoru kullanmak, boyanilan kontrol veya AD doku bolumlerinin hicbirinde mikrogliayi tanimlamamistir. Bununla birlikte, beyin bolumlerinde bulunan damarlarin icinde veya cevresinde bulunan yuvarlak hucrelerin (perivaskuler makrofajlar) guclu CD206 boyamasi dikkat cekiciydi. Bu, yayinlanmis bir bulguya benzerdir. Bu, alternatif aktive edilmis makrofajlarin damarlarda yaygin oldugunu gosterirken, alternatif aktive mikroglia noropilde bulunmadigini gostermektedir.


Insan beyinlerinde, beyin homojenatlarini kullanarak RNA veya protein seviyesinde inflamatuar iliskili molekullerin ekspresyonunun belirlenmesi, doku icinde onemli sayida kan hucresi sIkisabileceginden dikkatle yorumlanmalidir. Mikroglia ile ilgili gozlemler yapilirken bulgularin immunohistokimya ile dogrulanmasi gerekir. AD beyin orneklerinde alternatif aktive markorlerin yoklugu CD200 reseptoru (CD200R) icin dogrulandi. Bu, anti-enflamatuar sinyali induklemek icin ligand CD200 tarafindan aktive edilen miyeloid spesifik bir reseptordur. IL-4 ve IL-13 tarafindan induklendigini ve CD206’ya benzer bir M2a markorunun klasIk tanimina uydugunu gostermektedir.
Ar-Ge Sistemleri poliklonal antikoru (AF3414) ve ozel bir peptit antikoru dahil olmak uzere birkac antikor kullanarak, CD200R’nin protein ve mRNA ekspresyonu insan beyninde saptanabilir olsa bile, CD200R immunoreaktivitesini beyin mikroglia’da lokalize edilmemistir. Dokuda mikroglial profillemede gozden kacmis gorunen bir belirtec, LPS ko- reseptoru olan CD14’tur. Bu reseptor, proinflamatuar aktivasyon ile baglantili yukari regulasyona sahip klasIk bir M1 benzeri aktivasyon markorudur. CD14 icin insan AD beyinlerinde mikroglial immunohistokimyayi tanimlayan yalnizca tek bir calisma vardir. Kisa fiksasyon dokusunu kullanarak, bu markorun ekspresyonunu yeniden incelenmistir. Tum vakalarin cogu vaskuler makrofaji tarafindan guclu bir sekilde eksprese edilir, ancak artmis ekspresyon, AD vakalarinda IBA-1 mikroglia alt kumelerinde kolayca tespit edilebilir. CD14, TLR-2 veya TLR-4 ile etkilesim yoluyla proinflamatuar aktivasyon ile Ap’yi baglayabildiginden, artmis CD14 ekspresyonu, sitotoksIk mikrogliayi tanimlamak icin daha cok kullanilan bir isaret olabilir.Insan Beyninde Mikroglial Fenotipleme ile Ilgili Calismalar
Insan Beyninde TREM-2 Mikroglia Profilinin Cikarilmasi


Bu tartisma, TREM-2 pozitif mikroglianin mikroglial fenotiplemesini dikkate almak icin ozellikle onemlidir. TREM-2’nin AD’deki rolune buyuk ilgi, noroinflamasyon ve AD’ye yeni ilgiyi artirmistir. TREM-2 genindeki (rs75932628) TREM-2 proteininde (R47H) bir mutasyona neden olan tek bir nukleotid polimorfizmi (SNP), incelenen populasyona bagli olarak AD gelisme riskini 2 ila 11 kat artirabilir. TREM-2 veya onun adaptor proteini DAP12’deki mutasyonlar ilk olarak Nasu-Hakola hastaliginda tanimlanmistir ve bu da diger semptomlarin yani sira erken baslangicli demansa yol acar.


Mutasyon, normal islevi apoptotik noronlarin fagositozunu isi sok proteini 70’e (hsp70) veya lipidlerin farkli bicimlerine baglanarak tesvik etmek olan TREM-2 proteininin islev kaybina yol aciyor gibi gorunmektedir. Insan AD beyinlerinde TREM-2’nin immunohistokimyasina iliskin az sayida calisma yapilmistir, bu temelde patolojik calisma icin saglam antikorlarin eksIkliginden kaynaklanmaktadir. Plak ve karisma ile iliskili mikroglia’nin TREM-2 icin pozitif oldugunu gosteren ilk calismalardan birini yayinlanmistir. Bu calismada, insan beyin dokusunda ozgulluk ve duyarlilik icin bir dizi antikoru taramasi gerekir.
En iyi sonuclar, proteinin % 75’ine ve tam hucre disi alana karsilik gelen bir okaryotik hucre ekspresyonu proteini kullanilarak hazirlanan TREM-2’ye (AF1828) yonelik bir R&D Systems poliklonal antikoru ile elde edilmistir. Insan TREM2’nin (ab175262, Abcam, Cambridge, MA) N-terminal amino asitleri 29-59’a karsilik gelen bir peptit kullanilarak hazirlanan bir antikor kullanilarak AD frontal kortekste TREM-2 ekspresyonunun yakin zamanda yapilan bir calismasi, western blotlar ile ozgulluk gosterdi, ancak bu yazarlar TREM2 immunohistokimyasi hakkinda hicbir veri sunmamistir.


TREM-2 ekspresyonu, dendritik / miyeloid hucreler ile sinirlidir ve beyin mikroglialarinda yuksektir. Ticari antikorlarin ozgullugu, ayni zamanda tespit hassasiyeti de bir sorun olmustur. Iki calisma, TREM-2’nin beyindeki mikroglia tarafindan eksprese edilmedigi sonucuna varmistir, ancak her iki calismada da antijen geri kazanimi ile FFPE doku ornekleri kullanilmistir. Bir calisma, AR-GE antikorunun, yayinlanmis calismamiza benzer sekilde TREM-2 icin spesifik oldugunu, ancak mikroglial TREM-2 immunoreaktivitesini gosteremedigini gostermistir. Onceki calismaya benzer sekilde, parafine gomulmemis hafif sabitlenmis beyin dokulari kullanilmistir. Bu bolumlerle, mikroglia’ya spesifik TREM2 lokalizasyonunu gosterilebilmistir. Bulgu, TREM-2’nin AD modeli transgenik farelerde plakla iliskili mikroglia’da lokalize olmasi nedeniyle mantiklidir.



alıntı